DNA定量测定(二苯胺法)实验报告x
DNA的定量测定（二苯胺法）实验报告
一、 实验目的
掌握用二苯胺法定量测定 DNA含量的基本原理和方法。
二、 实验原理
? 在酸性环境中加热，DNA被水解为嘌呤，脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。其中脱氧核糖
在酸性条件下，脱水生成3-羟基- y-酮基戊糖，后者与二苯胺作用呈现蓝色，在
595nm处有最大光吸收。当样品 DVA的含量在40 — 400⑷范围时，光密度与 DNA的浓度 成正比。
样品中含有少量RNA不影响测定结果，但是蛋白质，脱氧核糖，阿拉伯糖和芳香醛等能 与二苯胺形成各种各样有色物质， 干扰结果。在反应中加入少量乙醛，可以提高反反应 灵敏度。
三、试剂与仪器
DNA标准液，二苯胺试剂，样品溶液
试管与试管架，吸管与洗耳球，可见分光光度计
四、DNA标准液曲线的制作与样品DNA含量的测定
1.取8支洁净干燥的试管，按下表操作:
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
标准
DNA溶
一
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
一
一
液
蒸馏水
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
一
一
—
二苯胺
试剂
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
样品
DNA溶
液
一
一
一
一
一
一
2.0
2.0
混合后，于60度水浴中保温1h
冷却至室温中，用分光光度计测定吸光值 A595nm
以DNA浓度为横坐标吸光值 A595nm为纵坐标，绘制标准曲线，对照组标准曲线计算样品中
DNA勺含量
五、实验结果与讨论
DNA标
准试管
1
2
3
4
5
6
试管1
试管2
Y:吸光
度
0.000
0.129
0.260
0.369
0.518
0.676
0.399
0.386
X:总
DNA浓
0
13.3
26.7
40
53.3
66.7
X1
X2
度（⑷）
0.8DN标准曲线度光吸Y*
0.8
DN标准曲线
度光吸Y
*系列1
——线性（系列1）
由图可知，标准曲线为 y=0.0098x，则求出的
Xi=40.71 ?/ml,X 2=39.39 用/ml
平均 DNA浓度为 40.05 旧/ml，含量 n%=40.05/100%=40.05%
分析：由实验的标准曲线求得的 DNA浓度40.05 冯/ml，在40-400用范围内，光密度与DNA
的浓度成正比，用标准曲线求得的浓度为准确值， 另外，由DNA的标准曲线的线性关系 R2 =
0.9966,证明DNA光密度的关系密切，则求出的浓度也就比比较精确。 但本实验测得的 DNA
含量比整体水平偏低，造成的原因可能是：
在吸取DNA溶液样品时，未充分摇匀，便吸取 2.0mlDNA样液，造成 DNA含量
不均，造成实验存在误差，另外，在加完试剂后，未摇后便至于 60度水浴保温，造成二苯
胺与DNA的脱水物结合不充分，造成吸光值的偏低，从而造成后续的计算，样品 DNA浓
度偏低。
进行分光光度测量时， 可能由于比色皿未充分洗涤， 有少量自来水的残留， 相当于
稀释了样品DNA浓度，使测得DNA吸光值偏低。
在吸取二苯胺试剂分别加入8支试管时， 由于采用了不同试瓶的二苯胺溶液， 造成
试剂间存在部分差异， 导致DNA的脱水物结合情况有所差别， 影响最后DNA吸光值的测
六、思考题
1.如何定何判断某些样品是否有核酸？
答：取了4支试管，按下表操作（ ml ）：
编号
1
2
3
4
样液
2 . 0
一
2 . 0
一
蒸馏水
一
2 . 0
一
2 . 0
地衣酚
一
2 . 0
2 . 0
一
二苯酚
2 . 0
一
一
2 . 0
沸水浴中加热10 min
观察试管内颜色变化，若1管变蓝，4管不变，则样品中含DNA，若3管变变绿，2管无
变化，则样品中含RNA, 若2, 3管不变绿，则样品中不含RNA, 若样品中不含RNA, 含1,4管不变蓝，则样品中不含DNA。
2 .实验中加入乙醛的目的是什么？
答：加入乙醛后，增加了二苯胺在溶液中的溶解度，同时使得DNA的显色量加深，便于观
察和增加测定对DNA含量的灵敏度，另外又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖等的干扰。